受汙染的物體和材料的表面可能是病毒傳播的重要途徑，自COVID-19 大流行以來，我們可能已經養成定期擦拭經常接觸的物體表面的習慣，但是對於能夠快速滅活任何一種病毒的新一代抗病毒材料的需求也在不斷增長。研究人員一般採取兩種主要途徑來研發新材料：使用天然抗病毒材料（例如銅和各種銅衍生物）或將抗病毒原料加入產品中
▲無孔材料
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ISO 21702的概述
ISO 21702標準是用來評價塑膠和其他無孔材料的抗病毒特性的檢測方法。將特定濃度的病毒負載到待測試樣本表面和對照樣本表面上，將其置於恆溫恆溼箱中作用24 h，然後用含中和劑的液體培養基洗脫樣品來回收存活的病毒，並測定從這些樣品中回收的具有感染性的病毒的數量，透過與對照樣本比較來確定待測試樣本是否具有抗病毒性。這一切雖然聽起來十分簡單，但是讓我們更深入地瞭解一下實驗過程，就會發現除了基本的抗病毒測試之外，ISO 21702標準的測試中還精心設定了許多組對照試驗和驗證試驗有效性的評價方法，以確保測試結果是可靠的、可重複的和有意義的。下面我們將對這些試驗細節進行介紹，以及告訴大家如何計算測試樣本的抗病毒活性。
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測試是如何進行的？
當測試一個材料表面的抗病毒活性時，本試驗應保證每種相同處理的測試材料有3個重複樣品，目的是減少差異性，增加試驗的可靠性，完整試驗至少需要12個對照樣本和9個待測試樣本。我們通常將樣品製備成 5 × 5 cm 的正方形，將一定量的病毒液滴加到每一塊待測樣本和對照樣本上，並用40 mm×40 mm的膜輕輕覆蓋住測試液，在（25±1）℃，90% RH條件下培養到指定時間（最長可達24小時）後，用含中和劑的液體培養基洗脫並回收存活的病毒。
接下來，我們將測定待測樣本和對照樣本的病毒存活情況，我們透過觀察宿主細胞被病毒侵染後的病變情況來確定病毒滴度。將洗脫回收的病毒接種到96孔板的細胞上，並進行10倍梯度稀釋，且每個稀釋梯度不少於4個復孔。將96孔板放入37 ℃、5 % CO2培養箱中孵育培養3~7天記錄細胞病變的情況，計算測試表面的抗病毒率。
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計算抗病毒活性
ISO 21702標準測定的是待測試樣本相對於對照樣本上病毒的減少量，這種減少量被稱為R值，是比較對照樣本和測試樣本中回收的病毒量之間的差異，都以10為底的對數值表示。若R≥1，則認為測試樣本具有一定的抗病毒活性。R=1相當於測試樣本中具有感染性的病毒相對於對照樣本減少了90%，R=2為減少了99%，R = 3為減少了99。9%，依此類推。
值得一提的是，R值是一個相對測量值（相對於對照樣品），因為隨著時間的推移，病毒在任何物體表面上都會產生自然衰亡而導致其活性降低。因此，我們所得到待測樣本的病毒減少量包含了自然衰減導致的“額外”的病毒失活效果。病毒活性的相對減少而不是絕對減少也有一些其他原因，如：實驗室條件可能每天都會有差異，使用的病毒也可能存在批次的差異等。
抗病毒活性
R=（Ut-U0）-（At-U0）=Ut-At
R為抗病毒對數值；
U0為未處理3個樣本0時刻回收的平均病毒滴度對數值；
Ut為未處理3個樣本24 h回收的平均病毒滴度對數值；
At為經過處理3個樣本24 h回收的平均病毒滴度對數值。
注：1）未處理試樣接種後立刻回收的滴度應在1。8×105 TCID50/cm2~8。5×105 TCID50 /cm2範圍內；
2）每個未處理樣品接觸24 h後回收的病毒滴度數不應少於4。3×102 TCID50 /cm2 。
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中和劑篩選及細胞毒性試驗
正如前面所述，ISO 21702標準測試依賴於培養的宿主細胞來驗證病毒是否具有感染性。最簡單的方法就是，我們透過在宿主細胞上接種回收的病毒來測定回收的感染性病毒的數量，透過觀察宿主細胞發生細胞病變（CPE）情況，來確定病毒數量的多少。因此，我們必須確定只能是由病毒引起宿主細胞的死亡。假設將待測試樣本有細胞毒的浸提液加入細胞培養板中，隨後殺死宿主細胞。如果沒有采取適當的措施，我們可能會錯誤地得出測試材料不能抗病毒的結論：“宿主細胞死亡，所以一定有很多存活的病毒”。
此時細胞毒性試驗便有了用武之地。在該試驗中，我們將液體培養基加入到待測樣本上，作用5 min後回收培養基，並將其接種到宿主細胞中。因為未接種病毒，所以如果宿主細胞死亡，我們就知道測試材料肯定存在細胞毒性，這樣的結果會使整個測試無效。因此，我們需要進行中和劑的篩選，確認所選的中和劑對宿主細胞無毒性，並能有效中和測試樣品中的有害物質。我們還應該注意，該測試僅評估在特定實驗室條件下洗脫回收的培養基的細胞毒性，旨在支援抗病毒測試的結論，這並不是評估真實環境中測試材料的細胞毒性。
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病毒對宿主細胞的敏感性試驗
ISO 21702 測試可能受到的另一個影響因素是測試材料是否會干擾宿主細胞對病毒的敏感性。假設測試材料向培養基中釋放了某種物質，使細胞對病毒產生了抵抗力，即使病毒具有活性，細胞也會存活，研究人員可能會錯誤地得出這種材料是具有抗病毒的結論：“宿主細胞存活，因此病毒一定已被殺死”。如果該材料以某種方式使宿主細胞對病毒特別敏感，那也是有問題的。而敏感性試驗可以防止這些情況發生。
在此實驗中，我們將（含中和劑）液體培養基新增到待測樣本試表面和對照樣本表面，等待5 min後回收培養基，然後將病毒液加入到回收的培養基中混勻並靜置30 min。我們還需將病毒加入到相同體積的（含中和劑）培養基中作為陰性對照，然後我們將上述含病毒的培養基接種到宿主細胞上。要注意的是，這裡的病毒從未與測試材料接觸過，因此我們預測會有能侵染宿主細胞的具有感染性的病毒。如果被殺死的宿主細胞比陰性對照要少得多或多得多，則該測試可能無效。簡而言之，如果待測試樣本和對照樣本表面某些物質溶解到培養基中，影響了正常的宿主細胞-病毒相互作用，我們就無法測試該材料是否會使病毒失活。這種情況下則需要對中和劑進行調整，如果中和劑進行調整了，則整個測試過程都需要進行調整。
將陰性對照、中和劑作用後處理和未處理樣品的病毒滴度進行比較，其對數值應滿足以下要求：
｜Sn-Su｜≤0。5
｜Sn-St｜≤0。5
Sn陰性對照滴度對數值，TCID50/ml
Su未經處理的樣本感染滴度對數值，TCID50/ml
St經過處理的樣本感染滴度對數值，TCID50/ml
如果滿足上述值，則可以進行下一步試驗。如果上述值＞0。5，這需要對中和劑進行調整。
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零時刻的病毒回收
病毒滴加到對照表面後立即加入培養基進行洗脫回收（零時刻），然後用回收的病毒液來計算實驗中病毒的初始量。如果病毒太少，這可能表明該病毒存在問題。這個試驗還可以得知從實驗過程中回收的最大病毒量，可以用來評估經過了特定時間後對照表面中的病毒感染性是否有所降低。
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額外的參考試驗
所有上述這些試驗對於確保正確解釋抗病毒測試的結果以及驗證有效測試的條件都具有重要意義。除了上述的ISO 21702中對照試驗之外，我們還設定了參考試驗包括一個陽性對照材料和一個陰性對照材料。陽性對照為經過驗證的具有抗病毒特性的材料，陰性對照是惰性塑膠或玻璃，即沒有抗病毒特性的材料。參考試驗中陰性對照組幾乎沒有病毒被滅活，陽性對照組則可以確保試驗準確進行，並且可以說明測試條件滿足材料抗病毒特性的評價。此外，它還可以比較我們的試驗條件隨時間的變化，以及不同實驗人員之間造成的誤差。
就像任何科學實驗一樣，對照實驗的數量往往會超過測試條件的試驗數量！對照試驗對於理解和解釋整個測試以及瞭解實驗過程中哪裡可能出錯至關重要。