上篇文章《歐易打造微生物多樣性描述葵花寶典（上）》與大家分享了資料OTU統計、群落結構、Alpha多樣性和Beta多樣性方面的描述建議，本篇繼續打造差異篩選、關聯分析和功能預測的超強攻略，相較於上篇基礎多樣性等方面的分析內容，下篇主要圍繞差異及功能等方面展開，也是文章撰寫的核心目標。
一、差異篩選
透過篩選與不同比較組差異顯著菌群，獲得與研究相關的重要標誌物。本部分結果是微生物多樣性的核心，其中篩選到的微生物與研究目的直接相關，其功能和機制也有待進一步挖掘。多組組間差異顯著性計算常用ANOVA、Kruskal Wallis演算法，當資料不滿足正態分佈，ANOVA分析則相對來說並非太合適，Kruskal Wallis檢驗就能針對不滿足正態分佈資料，進行組間比較。兩組組間差異顯著性計算常用Wilcoxon、T-Test演算法。篩選標準預設為p<0。05，也可以根據實際情況繼續縮小範圍，採用更小的p值或FDR來過濾。常用的差異資訊採用箱線圖或Heatmap圖來呈現（如下圖），都是基於相對丰度繪製，選其一即可，常見的差異物種分類水平為屬水平。
描述方法可以考慮描述具體演算法和篩選方式，針對關注物種進行深入討論，例如在Kruskal Wallis演算法中，根據FDR<0。05篩選到大腸桿菌有顯著性變化，透過文獻和資料庫查詢，確認其有哪些功能，後續透過驗證手段進一步探索機制。
（上圖描述示例：圖中顯示有顯著差異的前10個屬的相對丰度（Kruskal-Wallis，p<0。05）。結果發現，Aeromonas和Shewanella的相對丰度均高於對照組［1］。）
LEfSe分析在文章中也較常用（如下圖），用於揭示兩組或以上生物群落差異物種的組成，結果展示包括三部分，分別為差異物種對差異貢獻度大小分析、差異物種註釋分析和差異物種在每個樣本中的相對丰度情況，適用於後續biomarker研究的篩選。貢獻度大小根據LDA Score來評判，大於預設閾值的分類單元，即不同組中丰度差異顯著的分類單元，預設閾值2。0，也可以根據具體情況調整，值越大越顯著。
（上圖描述示例：Group-Mis中的幾種條件致病菌（包括Prevotellaceae_NK3B31_group， Bacteroidales_S24_7_group 和 Eubacterium ruminantium_group）均顯著偏高（LDA評分（log10） >3。0），而Prevotellaceae， Prevotella_1 和 Gammaproteobacteria是對照組中最豐富的微生物群（LDA評分（log10） >4。0）。這些結果表明，糞便微生物群組成的變化與流產有關［2］。）
二、關聯分析
在採用不同的分組比較差異微生物後，如何與生理指標進行關聯，是很多研究的重中之重，關聯分析就能很好的解決這個問題。透過將微生物資料與其他資訊計算相關性等方法，探討微生物對生理生化影響及組學互作等情況。可關聯的資料包括：物種之間、物種與表型資料、生理指標、代謝物丰度等，計算不同指標與微生物丰度之間的相關性和顯著性，相關性係數越高越好，顯著性p值越小越好。
文章中常見的呈現形式如相關性Heatmap圖、網路圖和CCA/RDA分析。Heatmap圖（如下圖）主要針對物種樣本間的相對丰度與表型等進行Spearman相關係數計算得出，根據結果可獲得表型與目標微生物的正負相關性，進而引入後續更深入的功能研究。
［3］
RDA/CCA 分析可以檢測環境因子、樣品、菌群三者之間的關係或者兩兩之間的關係（如下圖）。
描述方法可以根據微生物與環境因子等資訊的相關程度來展開，例如某優勢微生物與哪些指標正相關，哪些指標負相關，差異變數的關聯物種有哪些，具體的篩選顯著性p值或FDR是多少。
（上圖描述示例：該圖是描述細菌、理化指標和樣本間的關係，揭示了環境變數對土壤細菌群落的解釋率為41。69%，第一軸和第二軸的貢獻率分別為24。49%和17。2%。分析結果還揭示土壤細菌各屬與環境變化的相關性，不同土壤屬的主導因子不同。例如，土壤pH與Nocardioides， Escherichia-Shigella， MND1 和 Haliangium呈正相關，與 Rubrobacter， Solirubrobacter， Gemmatirosa 和 Geodermatophilus呈負相關。此外，取樣點的差異也可以透過環境變數反映出來，不同取樣點的土壤細菌丰度也表現出差異性。例如，AM中的相應樣本在Pseudonocardia向量上的投影點在AD的投影點之前，表明AM中的Pseudonocardia比AD具有更大的丰度潛力。由此可見環境因子，特別是SOM、TN、TP、pH和SWC與土壤細菌群落關係密切（p<0。05）［4］。）
（上圖描述示例：該圖是描述理化指標和樣本間的關係，透過RDA證實，第一軸和第二軸解釋物種水平表面細菌群落和環境因子累積方差的42。96%。溫度、鹽度、溶解氧和其他引數的p值分別為0。0015、0。0005、0。006和>0。32，由此說明溫度、鹽度和溶解氧是影響細菌群落的主要因素［5］。）
三、 功能預測
功能預測是透過預測已知微生物基因功能的構成，從而統計不同樣本和分組之間在功能上的差異。細菌常用PICRUSt功能預測分析，真菌常用FunGuild功能預測分析。該部分分析僅為預測結果，因此會有被編輯質疑的可能，建議附加宏基因組測序、熒光定量等手段，驗證功能基因以進一步證實結論。實際分析和實驗結果反映該預測的準確性和樣本有很大關係，其中腸道菌群和土壤菌群這些研究比較多的菌群，其預測準確度會相對高一些。常用的功能資料庫是KEGG資料庫，結果主要以Heatmap圖、柱形圖的形式展示（如下圖），值得注意的是，預測結果不能精確到某一物種，只能進行通路水平的預測和豐度分析。
描述內容主要根據關注功能展開，例如在不同比較組中某幾個通路有顯著差異，推測在不同處理其功能相關微生物群是有區別的。
（上圖描述示例：根據PICRUSt發現與CG組相比，來自其他組屬於BK患者眼睛微生物具有顯著不同的細菌基因功能組成。BK患者的眼部微生物組呈現出明顯更多與代謝、細胞過程、人類疾病、生物系統、環境資訊處理和遺傳資訊處理相關的基因，也就是說BK患者的眼部微生物群顯得更加活躍和具有攻擊性［6］。）
（上圖描述示例：透過PICRUST和KEGG富集研究，不同丰度的微生物主要富集在肽酶、丙酮酸代謝和TCA迴圈等代謝途徑中［7］。）
以上三部分涉及到分析小工具連結如下，老師可以根據需求進行個性化處理：
LefSe分析小工具連結：https：//cloud。oebiotech。cn/task/detail/LEfSe-oehw/
差異篩選小工具連結：https：//cloud。oebiotech。cn/task/detail/diffstatistic-oehw/
相關性分析小工具連結：https：//cloud。oebiotech。cn/task/detail/correlation-multiomics-oehw/
關聯散點圖小工具連結：https：//cloud。oebiotech。cn/task/detail/scatterplot-multiomics-oehw/
PICRUSt2功能預測小工具連結：https：//cloud。oebiotech。cn/task/detail/PICRUSt2-oehw/
總結上下篇共七部分內容，雖然文章不要求全部描述，但每部分都有各自特點和意義，老師可根據研究目的規劃組合方案。針對篩選到的差異微生物，可以根據文獻、資料庫等資訊獲得其研究進展，進一步探索其作用機制和前景。如想提高文章水平，可以考慮結合宏基因組、菌群移植、多組學聯合等手段，系統闡述作用機制和功能。其他個性化展示形式或高階分析需要根據具體需求選擇，此處不做深入展開。希望能給各位老師文章撰寫過程提供幫助。
注：本文內容僅供示例參考，其中涉及的結果內容描述和分析方法會有更多呈現形式，建議老師根據研究目的和結果進行最終判斷，如有不妥之處歡迎隨時交流。
參考文獻
［1］ Fei S A ， Yz A ， Zl A ， et al。 Bacillus subtilis H2 modulates immune response， fat metabolism and bacterial flora in the gut of grass carp （Ctenopharyngodon idellus）［J］。 Fish & Shellfish Immunology， 2020。
［2］ Liu YJ， Chen HN， Feng LP， et al。 Interactions between gut microbiota and metabolites modulate cytokine network imbalances in women with unexplained miscarriage［J］。 NPJ Biofilms Microbiomes， 2021。
［3］ Fu L ， Lu Y ， Tang L， et al。 Dynamics of methane emission and archaeal microbial community in paddy soil amended with different types of biochar［J］。 Applied Soil Ecology， 2021。
［4］ Jiang HM， Chen YC， Hu Y， et al。 Soil Bacterial Communities and Diversity in Alpine Grasslands on the Tibetan Plateau Based on 16S rRNA Gene Sequencing［J］。 Frontiers In Ecology and Evolution， 2021。
［5］ Gao P， Du GX， Zhao D， et al。 Influences of Seasonal Monsoons on the Taxonomic Composition and Diversity of Bacterial Community in the Eastern Tropical Indian Ocean［J］。 Front Microbiol， 2020。
［6］ Ren ZC， Liu Q， Li WF， et al。 Profiling of Diagnostic Information of and Latent Susceptibility to Bacterial Keratitis From the Perspective of Ocular Bacterial Microbiota［J］。 Front Cell Infect Microbiol， 2021。
［7］ Bai SY， Huang BQ， Fu S， et al。 Changes in the Distribution of Intrauterine Microbiota May Attribute to Immune Imbalance in the CBA/J×；DBA/2 Abortion-Prone Mice Model［J］。 Front Immunol， 2021。